Biochemie 1 Practicum Eiwit verslag

Biochemie 1 practicum
Eiwit: Isolatie, identificatie en
zuivering van -galactosidase

Samenvatting
Het doel van dit practicum was om His6--galactosidase te isoleren uit E. Coli bacterien, te
identificeren en te zuiveren tot een grote enzym opbrengst. De enzymen werden gesoleerd door BPER. De enzymen -galactosidase bezaten een His-tag van 6 histidine aminozuren. Deze His-tags
zorgde ervoor dat de enzymen bonden met het kolommateriaal HisPur Cobalt. Hierdoor konden de
enzymen worden gezuiverd door buffers toe te voegen met imidazol. Imidazol is een structuur
analoog van His6--galactosidase. De imidazol competeerde met de His6--galactosidase waardoor de
enzymen loslieten en in fracties konden worden opgevangen. Vervolgens zijn verschillende monsters
vanuit het practicum in een natieve PAGE op basis van hun lading en met een SDS-PAGE op basis van
hun grootte gescheiden om de monsters te identificeren. Om de eiwitten zichtbaar te maken werd
de SDS gel gekleurd met CBB en vervolgens ontkleurd. De Natieve gel werd gekleurd door X-gal. Na
de zuivering en identificatie werd de opbrengst en de zuiverheid bepaald met behulp van een
spectrofotometer en een Bradford-Assay. Uit de fracties die waren opgevangen uit de
fractieverzamelaar bleek dat er een oplopende imidazol concentratie zat in de piekfracties. Uit de
SDS-gel zijn geen resultaten af te lezen. Uit de natieve gel is af te lezen dat er actief His6-galactosidase zat in de laantjes 1, 3, 5, 6, 7, 8 en 9 zat. Door de gemeten absorbanties bij Prep 1, Prep
2 en Prep 3 blijkt dat er 5,1g eiwit in Prep 1 zat, 7,1g eiwit in Prep 2 zat en 9,1g eiwit in Prep 3.
Ook blijkt dat de enzymactiviteit toeneemt bij een oplopende tijd bij de monsters M1, M2b en Prep
3. De zuiveringsfactoren en de specifieke activiteiten van de enzymen zijn niet gemeten en berekend.

Inleiding
Enzymen zijn eiwitten die een specifieke reactie kan versnellen. De bacterie Escherichia Coli (E. Coli)
bezit in hun plasmide DNA een lacZ gen dat codeert voor het enzym -galactosidase. E. Coli
prefereert het gebruik van glucose als koolstofbron maar wanneer er geen glucose aanwezig is zal
lactose worden gebruikt. Het enzym -galactosidase is in staat om lactose om te zetten tot glucose
en galactose. De E. Coli bacterien in dit experiment bezaten een tag op de 5 kant van het gen lacZ.
Deze tag bestond uit 6 histidine aminozuren die ook op de -galactosidase enzymen zaten. In dit
practicum is het enzym His6-galactosidase gesoleerd, gedentificeerd en gezuiverd. De isolatie werd
gedaan door de bacterien te behandelen met B-PER, dit zorgde voor het openbreken van de cellen.
De eiwitten van de cellen werden hierbij niet gedenatureerd. De opengebroken cellen werden
gecentrifugeerd en toegevoegd aan kolom materiaal. De zuivering van His6--galactosidase werd
gedaan door middel van affiniteitschromatografie in de kolom. In het kolom materiaal zat onder
andere kobalt en kobaltionen. De His-tag op de enzymen binden met de kobaltionen waardoor de
His6--galactosidase in de kolom bond en zo bleef hangen. Andere eiwitten zonder His-tag stroomde
door de kolom heen en werden opgevangen. Na dit zuiveringsproces werd de His6--galactosidase
geelueerd door een buffergradient door de kolom te laten stromen. In het buffergradient zat
imidazol. Imidazol is een structuur analoog voor histidine wat competeert met de His-tag aan de His6-galactosidase waardoor de His6--galactosidase losliet van het kolom materiaal. De enzymactiviteit
van His6--galactosidase werd bepaald door fracties die vanuit de kolom werden opgevangen in een
fractieverzamelaar. Vervolgens werden verschillende monsters van de eiwitten die tijdens het
practicum zijn genomen onderzocht in twee verschillende polyacrylamide-gelelectroforeses (PAGE).
De identificatie van de His6--galactosidase werd gedaan door een SDS PAGE. Omdat eiwitten uit
verschillende aminozuren bestaan die verschillende ladingen hebben bij een bepaalde pH-waarde
kregen de eiwitten door de negatieve natriumdocecylsulfaat in de SDS dezelfde ladingsdichtheid en
werden zo gedenatureerd. De eiwitten werden daardoor gescheiden op massa. Na de
gelelektroforese werden de eiwitten zichtbaar gemaakt door kleuring. De kleuring werd gedaan door
Coomassie Briliant Blue R-250 (CBB) dat bond aan de eiwitten. Na de kleuring werd de gel ontkleurd.
Door de banden op de gel kon His6--galactosidase worden gedentificeerd. De activiteit van His6-galactosidase werd bepaald door een natieve PAGE. Eiwitten zijn negatief geladen bij een hoge pHwaarde en positief geladen bij een lage pH-waarde. Op een bepaalde pH-waarde hebben eiwitten
geen lading, dit is op het iso-elektrischpunt (pI). Omdat de pH in de scheidingsgel een waarde had
van 8,8 waren de eiwitten negatief geladen waardoor ze migreerde naar de positieve anode van de
gelelektorforese. De natieve gel werd na de gelelektroforese behandeld met 5-bromo-4-chloro-3indolyl--D-galactopyranoside (X-gal). De His6--galactosidase reageerde met X-gal tot D-galactose en
onstabiel 5-bromo-4-chloro-3-incoxyl. Deze onstabiele stof reageerde vervolgens met zuurstof wat
voor een blauwe kleur zorgde in de eiwit bandjes op de natieve gel. Als laatst werd met behulp van
een Bradford-assay in een spectrofotometer de absorbantie gemeten zodat de opbrengst en
zuivering berekend kon worden.

Materialen en methoden
De materialen en methoden die voor dit practicum zijn gebruikt staan vermeld in de handleiding
practicum biochemie 1 die geschreven is door M. H. De Smit en E. Vijgenboom. De versie van deze
handleiding is oktober november 2016.
Sommige gegevens staan niet in de handleiding beschreven, zo is er voor dit experiment in zaal 6
gewerkt met de pipetten met de nummers E3.09-3, de fractieverzamelaar op tafel 3 en met de
spectrofotometer op tafel 11. De spectrofotometer stond ingesteld op een golflengte van 595nm bij
de activiteitsmetingen. In zaal 4 is gebruik gemaakt van de pipetten met de nummers D2.09-11.
Het materiaal dat in de kolom werd gebruikt was de roze HisPur Cobalt. De buffers die hierbij
gebruikt waren werden buffer A, B en Z genoemd en zijn gemaakt in een eerder practicum door -. De
berekeningen die hierbij nodig waren luiden als volgt:
Buffer A (500ml)
De beschikbare stoffen waren: 0,2M Na2HPO4, 0,2M NaH2PO4 en 5M NaCl.
De benodigde stof was: 46,8mM Na2HPO4, 3,2mM NaH2PO4 en 300mM NaCl.
De verdunningsfactoren: - Na2HPO4: 200ml / 46,8mM = 4,27
500 * 1 / 4,27 = 117ml Na2HPO4
- NaH2PO4: 200ml / 3,2mM = 62,5
500 * 1 / 62,5 = 8ml NaH2PO4
- NaCl: 300ml / 5000mM = 16,7
500 * 1 / 16,7 = 30ml NaCl
Dit maakt een totaal volume van 117 + 8 + 30 = 155ml
Dit werd met 500 155 = 345ml Milli Q water aangevuld zodat er een totale hoeveelheid van 500ml
buffer A was.
Buffer B (250ml)
De beschikbare stoffen waren: 0,2M Na2HPO4, 0,2M NaH2PO4, 5M NaCl en 0,33M imidazol.
Imidazol heeft een moleculaire massa van 68,085 g/mol, dus het totaal aantal mol is 0,33M * 250ml
= 0,0825mol imidazol. Hierin zit 0,0825 * 68,085 = 5,6166 g imidazol.
De benodigde stoffen waren: 46,8mM Na2HPO4, 3,2mM NaH2PO4, 300mM NaCl en 300mM imidazol.
De verdunningsfactoren: - Na2POH: 200ml / 46,8mM = 4,27
250 * 1 / 4,27 = 58,5ml Na2PO4
- NaH2PO4: 200ml / 3,2mM = 62,5
250 * 1 / 62,5 = 4ml NaH2PO4
- NaCl: 300ml / 5000mM = 16,7
250 * 1 / 16,7 = 15ml NaCl
Dit maakt een totaal volume van 58,5 + 4 + 15 = 77,5ml, hierbij moest nog 125 77,5 = 47, 5ml Milli
Q water. Dit werd nog aangevuld met 125ml imidazol zodat een volume van 250ml buffer B werd
bereikt. De pH werd van deze buffer op 8,0 gemaakt door een paar druppels HCl.
Buffer Z (100ml)
Voor buffer Z waren geen berekeningen nodig. De buffer werd samengesteld door 30ml 0,2M
Na2HPO4, 20ml 0,2M NaH2PO4, 500l 2M KCl, 100l 1M MgSO4, 340l -mercaptoethanol en 49,06
ml Mili Q water.
Voor de berekening van mw en de pI-waarde van His6--galactosidase waren gegevens nodig van de
site www.ncbi.nlm.nih.gov/protein en web.expasy.org/compute_pi. De theoretische waarde voor de
mw was 118561,07 g/mol en 5,44 voor de pI.

Voor zowel de 10% SDS-PA-gel en de natieve gel zijn een stackinggel en een scheidingsgel gemaakt
van verschillende samenstellingen. Deze samenstellingen staan vermeld in de handleiding. De
natieve gel is gespoeld met een Z buffer zonder -mercaptoethanol. De SDS gel is overdag gekleurd
met CBB en ook overdag ontkleurd. De natieve gel is s nachts behandeld met X-gal.

Resultaten
Isolatie van His6--galactosidase
In dit practicum werden de cellen van E. Coli gesoleerd en gezuiverd in verschillende stappen. Er
werden verschillende monsters genomen die later gebruikt werden voor de zuiverheidsbepaling van
His6--galactosidase (Tabel 1). Van de gelyseerde E. Coli cellen werd een monster genomen van ruw
lysaat, dit monster werd M1 genoemd. Vervolgens werden de rest van de gelyseerde cellen
gecentrifugeerd waarna een doorzichtig gele supernatant was ontstaan met een pellet onderin het
buisje. De supernatant werd samengevoegd met het supernatant van -. De overgebleven pellet werd
geresuspendeerd met 1,5ml B-PER en nogmaals gecentrifugeerd tot er een doorzichtig supernatant
was gevormd. Dit supernatant werd toegevoegd bij het supernatant van de vorige extractie. Dit
geheel van supernatant had een inhoud van 1,5ml en werd de onoplosbare fractie (Prep 2) genoemd.
Van Prep 2 werd een monster van 200l genomen en M2b genoemd. De overgebleven pellet werd
opnieuw geresuspendeerd met 1ml buffer A en samengevoegd met de geresuspendeerde pellet van-. De gevormde onoplosbare fractie werd M2a genoemd. Het restant van de oplosbare fractie werd
met een hoeveelheid van 6ml aan het kolom materiaal toegevoegd. De vloeistof dat uit de kolom
kwam bezat ongebonden eiwitten en werd opgevangen in een bekerglas, hiervan werd een monster
van 500l genomen en M3a genoemd. Tijdens de elutie werden buffer A en B toegevoegd en fracties
van 1,5ml opgevangen in de fractievezamelaar. De 40 fracties werden in hoeveelheden van 5l
gepipeteerd in een 96-wells microtiterplaat, samen met 100l Z buffer en 20l ONPG. Van deze
fracties werden 4 monsters genomen. Het eerste 500l monster M3b werd genomen uit fractie
nummer 14 omdat hier nog geen enzym was geelueerd. Van de piekfracties 15,16 en 17 werden
500l monsters M3c, M3d en M3e genomen. Deze piekfracties hadden de meest gele kleur, dat
houdt in dat deze fracties de hoogste enzymactiviteit hadden (Figuur 1). De restanten van de
monsters M3c, M3d en M3e werden samengevoegd tot Prep 3 als gezuiverd enzym. De begin
concentratie imidazol was 330mM, deze werd verdeeld over de 40 fracties die werden verzameld.
Monster
Omschrijving
Volume

Ruw lysaat
200l
M2a
Onoplosbare fractie
~2ml
M2b
Oplosbare fractie
200l
M3a
Niet-gebonden eiwitten
500l
M3b
Vroege elutiefractie
500l
M3c
Piekfractie 1
500l
M3d
Piekfractie 2
500l
M2e
Piekfractie 3
500l
Prep 3
Gezuiverd enzym
9,5ml
Tabel 1. De gegevens van de genomen monsters tijdens het practicum om later in het practicum een
zuiverheidsbepaling te doen.

Piekfractie 1: 330mM / 40 fracties * 15 (fractie) = 123,75mM imidazol
Piekfractie 2: 330mM / 40 fracties * 16 (fractie) = 132mM imidazol
Piekfractie 3: 330mM / 40 fracties * 17 (fractie) = 140,25mM imidazol
In de piekfracties zat een oplopende concentratie imidazol.

Figuur 1. De 96-wells microtiterplaat met de 40 fracties samengevoegd met 100l Z buffer en 20l ONPG.
Hierop zijn de meest gele welletjes de piekfracties, dat zijn nummer 15,16 en 17.

SDS-PAGE
Bij de gelelektroforese werden de eiwitten op hun grootte gezuiverd in een polyacrylamide gel. Door
de stof SDS kregen de eiwitten dezelfde lading waardoor de lading van de eiwitten geen invloed had
op de resultaten. De eiwitten migreerde op basis van hun massa. Na de elektroforese werd de gel
gekleurd voor een halfuur met 10ml CBB-oplossing. Na de kleuring werd de gel ontkleurd. Omdat de
CBB-oplossing bond aan de eiwitten bleven de eiwitten blauw gekleurd.
In de eerste laan van de SDS gel zit 1l monster M1, in de tweede laan zit 1l van monster M2a en in
de derde laan zit 1l van monster M2b. In laan nummer 4 zit een marker om algemene waarden te
vergelijken in de rest van de laantjes. In laan 5 zit 10l van monster M3a, in laan 6 zit 10l van
monster M3b, in laan 7 zit 10l van monster M3c, in laan 8 zit 10l van monster M3d en in laan 9 zit
10l van monster M3e. Als laatst zit er in laan 10 10l van Prep 3. Bij de monsters M1, M2a en M2b
is ook nog 10l SDS-samplebuffer en 9l buffer A toegevoegd. Bij de monsters M3a, M3b, M3c, M3d,
M3e en Prep 3 is ook 10l SDS-samplebuffer toegevoegd. Dit resulteert dat er in elke laan een
hoeveelheid van 20l is gepipetteerd.
In geen enkele laan is resultaat te zien of af te lezen (Figuur 2). Ook de algemene marker is niet af te
lezen. Hieruit kunnen geen resultaten worden opgemaakt enbeschreven. Op het blote oog leken de

meeste blauw gekleurde eiwitten boven in de gel te hangen. Er waren ook lichte sporen te zien dat
er wel laantjes waren gevormd. De algemene marker kon eiwitgroottes van 250KDA tot en met
10KDA aantonen. KDA is de waarde in kilo Daltons.

Figuur 2. De SDS-gel die gebruikt is voor de identificatie van de His6--galactosidase. In deze gel zijn geen
resultaten af te lezen.

Natieve PAGE
Bij de gelelektroforese werden de eiwitten gezuiverd op basis van hun lading in een
polyacrylamidegel. De pI van het eiwit His6--galactosidase is 5,44. De gel waar de eiwitten door
migreerde hadden een hogere pH waardoor de eiwitten naar de positieve anode werden getrokken.
Na de gelelektroforese werd de gel gekleurd door de gel te behandelen met Z buffer en X-gal, dit
moest in het donker, dit gebeurde s nachts. De His6--galactosidase reageerde met X-gal tot Dgalactose en onstabiel 5-bromo-4-chloro-3-incoxyl. Deze onstabiele stof reageerde vervolgens met
zuurstof wat voor een blauwe kleur zorgde in de eiwit bandjes op de natieve gel. In de eerste laan zit
1l van het monster M1, in de tweede laan zit 1l van het monster M2a, in de derde laan zit 1l van
het monster M2b, in de vierde laan zit 2l van het monster M3a, in de vijfde laan zit 10l van het
monster M3b, in de zesde laan zit 10l van het monster M3c, in de zevende laan zit 10l van het
monster M3d, in de achtste laan zit 10l van het monster M3e en tot slot zit er in laan 9 10l van het
monster Prep 3. De eerste drie laantjes zijn aangevuld met 9l buffer A en 10l natieve
samplebuffer. Laan nummer 4 is aangevuld met 8l buffer A en 10l natieve samplebuffer. De
laantjes met de nummers 5, 6, 7, 8 en 9 zijn aangevuld met 10l natieve samplebuffer.

Laan nummer 1 heeft de meest felle blauwe kleur, monster M1 had het meeste His6--galactosidase
omdat dit monster het minst gezuiverd was (Figuur 3). In laan 2 is geen resultaat af te lezen. In laan 3
is een iets minder felle blauwe laan dan laan 1 te zien, hieruit blijkt dat er in laan 3 minder His6-galactosidase zit dan in laan 1 door de zuivering. In laan 4 begint de laan met een blauwe kleuring die
vervolgens verdwijnt, hieruit blijkt dat er weinig His6--galactosidase in het monster aanwezig was en
bovenin de gel bleef hangen. De meeste His6--galactosidase is in het kolommateriaal blijven hangen.
In de laantjes 5 tot en met 9 zijn soortgelijke resultaten af te lezen. Bij deze laantjes zijn bandjes met
His6--galactosidase op dezelfde manier af te lezen. Omdat laantje 6, 7 en 8 de piekfracties bezaten
moesten deze er ongeveer hetzelfde uitzien. Toch is de band bij laan 8 wat smaller en minder fel, dit
betekend dat de piek van de enzymactiviteit al afliep bij monster M3e. Uit deze gegevens is te
concluderen dat laan 1, 3, 5, 6, 7, 8 en 9 actief His6--galactosidase bezat en dat de laantjes 5 tot en
met 9 zuiverder waren dan laan 1 en 3.
Er is geen duidelijk verschil tussen de tetrameren en monomeren aan te tonen op de natieve gel. De
onderste banden moeten de monomeren zijn omdat deze eiwitten kleiner zijn en sneller door de gel
kunnen migreren.

Figuur 3. De natieve gel die is gebruikt voor de bepaling van de enzymactiviteit van His6--galactosidase.
In deze gel is af te lezen dat er actief His6--galactosidase zat in de laantjes 1, 3, 5, 6, 7, 8 en 9 zat.

Bepaling van de opbrengst en zuiverheidsfactor
Bij dit practicum werd bepaald of de His6--galactosidase goed gezuiverd was en of er ook een goede
opbrengst van was. De monsters M1, Mb2 en Prep 3 werden daarom onderzocht in een
spectrofotometer die ingesteld was op een golflengte van 595nm. Uit de gemeten absorbantie
waarden konden de eiwitgehaltes worden bepaald door ze te vergelijken met een ijklijn uit een
eerder practicum (Figuur 4).

Eiwit absorbantie ijklijn bij een golflengte van 595nm
0.1

y = 0.0093x - 0.0064
R = 0.9678

Absorptie (A)

0.08
0.06

Absorptie ijklijn BSA
0.04

Linear (Absorptie ijklijn
BSA)

0.02


-0.02


gewicht BSA (g)

Figuur 4. De eiwit arsorbantie ijklijn bij een golflengte van 595nm die het verband tussen de hoeveelheid
eiwit en de absorbantie. De formule die hoort bij deze ijklijn is y=0,0093x 0,0064. De R2 is bijna 1 dus de
lijn is zo goed als lineair.

De absorbantie werd gemeten van 3 monsters (Tabel 2); Prep 1, Prep 2 en Prep 3. In Prep 1 zat het
ruwe lysaat dat ook in monster M1 zat en in Prep 2 zaten de opgeloste eiwitten die ook in monster
M2b zaten. Prep 3 is al eerder gebruikt, hierin zaten de gezuiverde enzymen.
Berekeningen van de hoeveelheid eiwitten:
- Prep 1: 0,041 = 0,0093x 0,0064
0,0474 = 0,0093x
x = 5,1 g
- Prep 2: 0,060 = 0,0093x 0,0064
0,0664 = 0,0093x
x = 7,1 g
- Prep 3: 0,078 = 0,0093x 0,0064
0,0844 = 0,0093x
x = 9,1 g

Monster
Absorbantie
Eiwit in Assay (g)
Prep 1
0,041
5,1
Tabel 2. De gemeten absorbanties bij een golflengte
Prep 2
0,060
7,1
van 595nm van0,078
de monsters Prep 1, Prep 2 en Prep 3
Prep 3
9,1
met de berekende hoeveelheid eiwit.

Om de totale hoeveelheid eiwitten te berekenen tijdens de verschillende stappen van de opzuivering
zijn verschillende berekeningen gemaakt (Tabel 3).

Grootheid

Gemeten
absorbantie

Eenheid

Symbool en/of
berekening

Prep 1: Ruw
lysaat

A595

0,041

Prep 2:
Oplosbare
eiwitten
0,060

Prep 3:
Gezuiverd
enzym
0,078

Eiwit in Assay

5,1
7,1
9,1
Eassay


Volume prep in

0,5 * 10
1,0 * 10
0,5 * 10-3
Vprep-in-assay
assay*
Eiwitconcentratie in g/ml
1,42 * 104
1,82 * 104
[E]prep = Eassay / 1,02 * 104
preparaat
Vprep-in-assay
Volume

1,61

9,5
Vprep
preparaat**
Eiwit in

85,2
172,9
Eprep = [E]prep * 16,4
preparaat**
Vprep / 1000
Tabel 3. Berekende gegevens van de hoeveelheid eiwitten tijdens de zuivering. * Het volume aan
onverdund enzympreparaat dat aan het Bradford-Assay is toegevoegd. ** Het originele preparaat
waaruit de monster genomen is, dus Prep 1, Prep 2 en Prep 3.
De activiteit van His6--galactosidase kon worden bepaald door ONPG-Assay uit te voeren. Voor M1
is een oplossing bereid die bestond uit 800l Z buffer, 160l ONPG, 13l monster M1 met een
verdunning van 80x en dat is aangevuld met 27l Mili Q water. Voor M2b is een oplossing bereid die
bestond uit 800l Z buffer, 160l ONPG, 22l monster M2b met een verdunning van 100x en 18l
Mili Q water. De laatste oplossing die bereid is voor Prep 3 bestond uit 800l, 160l ONPG, 5l
onverdund Prep 3 van - en 35l Mili Q water. Deze metingen zijn in duplo uitgevoerd en daarvan is
het gemiddelde genomen, uit deze gegevens van de spectrofotometer is de absorbantie tegenover
de tijd bepaald (Figuur 5).

Activiteit metingen
1.8
y = 0.0073x + 0.115
R = 0.9981

1.6
1.4

y = 0.0067x + 0.3327
R = 0.9892

Absorbantie

1.2

y = 0.0071x + 0.1158
R = 0.996


0.8
0.6
0.4
0.2


100

120

140

160

180

200

tijd (s)
Series1

Series2

Series3

Linear (Series1)

Linear (Series2)

Linear (Series3)

Figuur 5. De metingen van de enzymactiviteit over de tijd. Reeks 1 is monster M1 met de formule
y=0,0073x + 0,115 en R2 = 0,99805. Reeks 2 is monster M2b met de formule y=0,0071x + 0,1158 en R2 =
0,99603. Reeks 3 is monster Prep 3 met de formule y=0,0067x + 0,3327 en R2 = 0,98922.
Wegens tijdnood zijn de experimenten 2.7.2 Bepaling van de extinctiecoefficient van ONP en 2.7.3
Berekeningen niet voltooid. Er missen gegevens van deze experimenten (Tabel 4).

Voor de bepaling van de extinctiecoefficient was de wet van Lambert-Beer; A = e * C * D.

Bij deze wet is A de absorbantie op een golflengte van 420nm, e de molaire extinctiecoefficient, C de
concentratie in molair en D de lengte van de cuvet in cm.
ONP ontstaat na de reactie van His6--galactosidase en ONPG.
Grootheid

Eenheid

Symbool en/of
berekening

Prep 1: Ruw
lysaat

Prep 2:
Oplosbare
fractie

Prep 3:
gezuiverd
enzym

Gemeten
reactiesnelheid
Volume van
assay
Activiteit in
assay
Volume aan
prep in assay*
Volume van
preparaat
Activiteit in
preparaat**

M/s


Vassay

0,001

0,001

0,001

mol/s


Zassay = V0 *
Vassay
Vprep-in-assay

0,5 * 10-3

1,0 * 10-3

0,5 * 10-3


Vprep

mol/s

Zprep = Zassay *
(Vprep / Vprep-inassay)
(Zprep /
Zprep,Prep1)
Eprep

Opbrengst


100%

Eiwit in

16,4
85,2
172,9
preparaat**
Specifieke
mol * sZsp = Zprep /

activiteit
mg-1
Eprep
Zuiveringsfactor

Zsp / Zsp,Prep1
Tabel 4. De niet complete bepaling van opbrengsten, specifieke activiteiten en zuiveringsfactoren. * Het
volume aan onverdund enzympreparaat dat in de reactiemix gepipetteerd is. ** Het originele preparaat
waaruit het monster genomen is, dus Prep 1, Prep 2 en Prep3.

Discussie
Het doel van dit practicum was om His6--galactosidase te isoleren uit E. Coli bacterien, te
identificeren en te zuiveren tot een grote enzym opbrengst. Het doel is niet volledig gelukt.

De natieve gel was goed gemaakt, na de gelelektroforese bleek er geen natieve sample buffer te zijn
toegevoegd waardoor er geen bandjes van eiwitten waren af te lezen. De SDS gel was vaker mislukt
omdat er tijdens de polymerisatie lucht bij de slotjes kwam. Zowel de natieve gel als de SDS gel zijn
meerdere malen gemaakt. Bij de SDS-gel is ook een keer een verkeerde scheidingsgel gemaakt.
Uiteindelijk is een extra SDS gel van Mike Eterman en Chandan Harpal gebruikt, deze stond al even
droog. Op de SDS gel waren geen resultaten te zien, de gel was vrij blauw dus de ontkleuring zal niet
lang genoeg hebben geduurd. Omdat het op het oog leek dat de eiwitten nog bovenin de SDS gel
zaten was de gel waarschijnlijk te droog om de eiwitten goed te laten migreren. Wegens het moeten
verlaten van de practicumzaal heeft de natieve gel niet lang genoeg gelopen waardoor er geen
onderscheid te zien was tussen de mono- en tetrameren. Bij de activiteitsmetingen werd er naar een
waarde van 1,5 gestreefd op een tijd van 180 sec. Dit bleek achteraf niet nodig. Door het maken van
de vele gels en de extra activiteitsmetingen is veel tijd verloren waardoor experiment 2.7.2 Bepaling
van de extinctiecoefficient van ONP en 2.7.3 De berekeningen niet zijn gelukt.
Door de missende resultaten is niet bekend of de eiwit opbrengst 100% was, hoeveel His6-galactosidase is opgebracht en of er His6--galactosidase is achtergebleven. Mocht er His6-galactosidase achtergebleven zijn zal dat gebeurd zijn tijdens de verschillende zuiveringsstappen. Er
is geen conclusie te trekken of de SDS-PAGE bruikbaar is voor de bepaling van de molaire massa van
een eiwit. Op basis van de missende resultaten in het practicum is niet af te leiden of de
zuiveringstechnieken die gebruik maken van een His-tag nuttig is voor het verkrijgen van grote
hoeveelheden zuiver eiwit.