Biochemie 1 Practicum Eiwit verslag

Het eiwit verslag voor het practicum van het vak Biochemie 1.

Preview document (1 van de 11 pagina's)

Biochemie 1 practicum
Eiwit: Isolatie, identificatie en
zuivering van ß-galactosidase
Samenvatting Het doel van dit practicum was om His6-ß-galactosidase te isoleren uit E. Coli bacteriën, te
identificeren en te zuiveren tot een grote enzym opbrengst. De enzymen werden geïsoleerd door B-
PER. De enzymen ß-galactosidase bezaten een His-tag van 6 histidine aminozuren. Deze His-tags
zorgde ervoor dat de enzymen bonden met het kolommateriaal HisPur Cobalt. Hierdoor konden de
enzymen worden gezuiverd door buffers toe te voegen met imidazol. Imidazol is een structuur
analoog van His6-ß-galactosidase. De imidazol competeerde met de His6-ß-galactosidase waardoor de
enzymen loslieten en in fracties konden worden opgevangen. Vervolgens zijn verschillende monsters
vanuit het practicum in een natieve PAGE op basis van hun lading en met een SDS-PAGE op basis van
hun grootte gescheiden om de monsters te identificeren. Om de eiwitten zichtbaar te maken werd
de SDS gel gekleurd met CBB en vervolgens ontkleurd. De Natieve gel werd gekleurd door X-gal. Na
de zuivering en identificatie werd de opbrengst en de zuiverheid bepaald met behulp van een
spectrofotometer en een Bradford-Assay. Uit de fracties die waren opgevangen uit de
fractieverzamelaar bleek dat er een oplopende imidazol concentratie zat in de piekfracties. Uit de
SDS-gel zijn geen resultaten af te lezen. Uit de natieve gel is af te lezen dat er actief His6-ß-
galactosidase zat in de laantjes 1, 3, 5, 6, 7, 8 en 9 zat. Door de gemeten absorbanties bij Prep 1, Prep
2 en Prep 3 blijkt dat er 5,1µg eiwit in Prep 1 zat, 7,1µg eiwit in Prep 2 zat en 9,1µg eiwit in Prep 3.
Ook blijkt dat de enzymactiviteit toeneemt bij een oplopende tijd bij de monsters M1, M2b en Prep
3. De zuiveringsfactoren en de specifieke activiteiten van de enzymen zijn niet gemeten en berekend.